Санпин для детских садов с изменениями 2020 прогулки с детьми

id="v-sanpin-2.4.1.3049-13-vneseny-izmeneniya-blog-inspektora-narodnogo-obrazovaniya" >В СанПиН 2.4.1.3049–13 внесены изменения — Блог инспектора народного образования

Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 27 августа 2015 года N 41 в СанПиН 2.4.1.3049–13 ( для дошкольных образовательных организаций) внесены изменения, которые вступили в силу 20 сентября 2015 года. Согласно внесенным изменениям:

1.Действие СанПиН 2.4.1.3049–13 распространяется на деятельность по уходу и присмотру за детьми в дошкольных группах, размещенных во встроенных, встроенно-пристроенных к жилым домам зданиях (помещениях) и зданиях административного общественного назначения (кроме административных зданий промышленных предприятий). При этом к дошкольным группам, размещенным в жилых помещениях жилищного фонда, санитарные правила не применяются.

2.Исключено предельное возрастное ограничение по приему детей в детские сады. Теперь дети будут приниматься в дошкольную образовательную организацию в возрасте от двух месяцев до прекращения образовательных отношений (сейчас — до 7 лет).

3.Для дошкольных образовательных организаций, оказывающих услуги по присмотру и уходу за детьми допускается использование оборудованных мест для прогулок детей и занятий физкультурой, расположенных на территории скверов, парков и других территориях, которые приспособлены для прогулок детей и занятий физкультурой. 4. Уточнено, что количество кроватей в детских садах должно соответствовать количеству детей, находящихся в группе. При этом исключена норма об обеспечении детей индивидуальными постельными принадлежностями, полотенцами, предметами личной гигиены. Однако сохранена норма, согласно которой на каждого ребенка необходимо иметь три комплекта белья, включая полотенца для лица и ног, и две смены наматрасников.

4.Запрещено проведение сквозного проветривания помещений детского сада в присутствии детей и через туалетные комнаты. Проветривание проводится не менее 10 минут через каждые 1,5 часа.

5.Уточнена кратность приема пищи и режим питания детей. Так при 8-10-часовом пребывании детей должно быть организовано 3-4-разовое питание, при 10,5-12-часовом – 4-5-разовое питание, при 13-24-часовом – 5-6-разовое питание. Между завтраком и обедом возможна организация второго завтрака. Подчеркивается, что для детей, начиная с 9-месячного возраста, оптимальным является прием пищи с интервалом не более 4 часов.

6.Внесены поправки в температурный режим. Например, в спальнях, туалетных комнатах температура воздуха должна быть не ниже 19 градусов (ранее – 19-20), в игровых – 22 (ранее – 21-23).

7.Изменена примерная схема питания детей первого года жизни. В частности, расширен перечень продуктов и блюд, а также уточнены объемы их употребления по месяцам жизни ребенка.

Источник: ГАРАНТ.РУ: http://www.garant.ru/news/651621/

«Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, содержанию и организации режима работы дошкольных образовательных организаций»

постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 27 августа 2015 г. № 41

Пропустил день, неси справку. Законны ли новые требования омских школ и детских садов? – Новости Омска

Во время учебного года родители часто сталкиваются с ситуацией, когда ребёнка нужно «немного подлечить». Как правило, в таких случаях посещать образовательное учреждение не рекомендуется, иначе можно попасть в неловкую ситуацию и заразить других детей. Если ребёнок всё же разболелся и без помощи врача не обошлось, то возвращаться в школу или детский сад необходимо только со справкой.

В детском саду можно пропустить 5 дней без предъявления справки. При этом выходные и праздничные дни не учитываются. Значит, по факту, можно пропустить целую неделю.

Постановление Главного санитарного врача РФ «Об утверждении СанПин 2.4.1.3049–13 Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, содержанию и организации режима работы дошкольных образовательных организаций» пункт 11.3 гласит, что ребёнок должен предоставить справку при отсутствии более 5 дней, за исключением праздничных и выходных дней.

Важно заметить, что если ребёнок заболел и понадобилась помощь врача, то в таком случае справку необходимо будет предоставить, даже если удалось вылечиться за 5 дней.

При первичном посещении детского сада необходимо предоставить справку с пометкой об отсутствии контакта с коронавирусными больными.

Пропустили один день? Будьте добры предоставить справку

Со школами дела обстоят иначе. В разных школах предоставляют разную информацию по вопросам пропуска учащихся без справки. Родители одной омской школы рассказали, какие правила установлены у них:

«У ребёнка немного приболело горло, я решила за выходные его немного подлечить и захватить понедельник. Спросила у классного руководителя: можно в понедельник один день не выйти? Она ответила, что в связи с ковидом правила ужесточились. Теперь даже если пропускаешь один день, необходимо основание, почему ребёнок отсутствовал. Раньше можно было пропустить не более 4-х дней».

Похожая ситуация обнаружилась ещё в одном образовательном учреждении. Омичка поделилась, что без справки нельзя пропускать ни одного дня, однако если пропуск по семейным обстоятельствам, то можно написать заявление.

Возвращаемся к постановлению Главного санитарного врача РФ:

«Санитарно-эпидемиологические требования к условиям и организации обучения, содержания в общеобразовательных учреждениях» гласят, что обучающиеся допускаются к занятиям в общеобразовательной организации после перенесённого заболевания только при наличии справки врача-педиатра.

Никакой речи о количестве дней, которые можно пропустить нет. Школы вправе сами определять допустимое количество дней, которые можно не посещать без предъявления справки. Ознакомиться с этими распоряжениями можно на официальном сайте нужной школы, в правилах внутреннего распорядка обучающихся.

«При неявке обучающегося на занятия по болезни или другим уважительным причинам, обучающийся обязан в течение первого дня болезни поставить об этом в известность классного руководителя; в случае болезни обучающийся предоставляет справку амбулаторного врача или лечебного заведения по установленной форме», — написано на сайте одной из школ города.

В другой школе можно воспользоваться запиской от родителей за пропуск занятий: «Нельзя без разрешения педагогов уходить из школы и с ее территории в урочное время. В случае пропуска занятий обучающийся должен предъявить классному руководителю справку от врача или записку от родителей (законных представителей) о причине отсутствия на занятиях. Пропускать занятия без уважительных причин не разрешается».

В пресс-службе департамента образования рассказали, какие правила действуют в регионе:

Закон «Об образовании в РФ» ничего не говорит о том, сколько дней позволено пропускать школу. В школах самостоятельно определяют допустимые сроки отсутствия на занятиях. Уважительная причина должна быть указана в заявлении, которое нужно написать на имя директора. В нем также нужно прописать просьбу освободить ребенка от уроков на необходимое время. Справка от врача после этого в школе не нужна. Если же ребенок пропустил занятия по причине болезни, справка о состоянии здоровья обязательна. Ребенок может пропустить школу в срок менее 3-х дней до открытия больничного. Регулировку правил предусматривают внутренние акты, установленные школой.

Исходя из вышесказанного можно предположить, что при отсутствии 1-2 дней можно не обращаться за справкой к педиатру. Но каждая школа имеет полное право диктовать свои условия на этот счёт. В случае длительного отсутствия можно написать заявление с указанием интервала времени, в который будете отсутствовать и причину.

Возможно, из-за напряжённой эпидемиологической ситуации школы хотят себя обезопасить и требуют справки даже за один день пропуска. Во всех учреждениях проводятся утренние фильтры, которые помогают выявить температуру у ребёнка или первые признаки ОРВИ.

На пресс-конференции, посвященной соблюдению масочного режима в Омской области первый заместитель директора департамента образования Наталья Васильева подчеркнула, что прежние правила сейчас не действуют. В школе действительно имеют право потребовать справку за пропуск даже одного дня учёбы, чтобы удостовериться, что ребёнок не болеет. По словам спикера, до пандемии школьнику позволялось «пересидеть один день дома» и не предъявлять документов о состоянии здоровья, однако сейчас сложилась иная ситуация.

«В сложившихся обстоятельствах каждый родитель и руководитель должны обеспечить сохранение здоровья», – цитирует Наталью Васильеву Город55.

Вопрос

При пропуске скольких дней в вашей школе начинают требовать справки?

• 1 день
• 3 дня
• 4 дня

Для участия в голосовании

Уже почти 80. Омские школы продолжают закрывать на карантин из-за коронавируса и ОРВИ

Модуляция клеточного распределения геликазы цитомегаловируса человека с помощью Snapin клеточного фактора

РЕЗЮМЕ

Контролируемая регуляция синтеза геномной ДНК – это универсально консервативный процесс для всех герпесвирусов, включая цитомегаловирус человека (HCMV), и играет ключевую роль в вирусном патогенезе. такие как стойкие инфекции. Считается, что HCMV UL105 кодирует геликазу механизма репликации ДНК, который должен локализоваться в ядрах, месте синтеза вирусной ДНК.Факторы хозяина, которые взаимодействуют с UL105, не идентифицированы. В этом исследовании мы показываем, что UL105 специфически взаимодействует с Snapin, человеческим белком, который преимущественно локализован в цитоплазме и связан с клеточными везикулами. Было обнаружено, что UL105 взаимодействует со Snapin как в дрожжевом двугибридном скрининге, так и в экспериментах по коиммунопреципитации в клетках, инфицированных HCMV. Ядерный и цитоплазматический уровни UL105 были снижены и увеличены в клетках, сверхэкспрессирующих Snapin, соответственно, в то время как уровни UL105 в ядрах и цитоплазме увеличивались и уменьшались в клетках, в которых экспрессия Snapin подавлялась малой интерферирующей РНК анти-Snapin ( миРНК) соответственно.Кроме того, синтез вирусной ДНК и продукция потомства снижались в клетках, сверхэкспрессирующих Snapin, и увеличивались в клетках, обработанных анти-Snapin siRNA, соответственно. Наши результаты являются первым прямым доказательством того, что Snapin взаимодействует с UL105 и изменяет его клеточное распределение, что приводит к модуляции синтеза вирусной ДНК и продукции потомства. Наше исследование также предполагает, что модуляция клеточного распределения вирусной геликазы с помощью Snapin может представлять собой возможный механизм регулирования синтеза геномной ДНК HCMV, ключевой этап во время литических и персистирующих инфекций герпесвируса.

ВВЕДЕНИЕ

Цитомегаловирус человека (HCMV) является членом семейства герпесвирусов, которое включает вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус Эпштейна-Барра (EBV) и вирус герпеса, связанный с саркомой Капоши (KSHV) (1) . Этот вирус вызывает легкие или субклинические заболевания у иммунокомпетентных взрослых, но может привести к тяжелой заболеваемости или смертности у новорожденных и лиц с ослабленным иммунитетом (1, 2). HCMV может инфицировать широкий спектр тканей и клеток, таких как нейрональные клетки, и, как и все другие герпесвирусы, он может вызывать литические, стойкие и латентные инфекции во многих из этих тканей (3, 4).Во время литической продуктивной инфекции продукты гена HCMV экспрессируются во времени, и их экспрессия состоит из трех последовательных фаз, описываемых как немедленная ранняя (IE), ранняя (E) и поздняя (L) фазы (1). Процесс синтеза вирусной ДНК, который происходит в ядре инфицированных клеток (5), является высококонсервативным среди всех герпесвирусов и является мишенью для большинства современных антигерпесвирусных терапевтических агентов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (6).

Литическая репликация ДНК герпесвирусов считается сложным и строго регулируемым событием.Комплекс репликации вирусной ДНК содержит не менее шести основных белков, консервативных у всех герпесвирусов (1, 7). Факторы репликации HCMV состоят из двухсубъединичной ДНК-полимеразы, кодируемой UL54 и UL44, одноцепочечного ДНК-связывающего белка, кодируемого UL57, примазы, кодируемой UL70, геликазы, кодируемой UL105, и фактора, связанного с примазой-геликазой. кодируется UL102. Репликация ДНК в HCMV считается аналогичной репликации в HSV и других герпесвирусах с функцией нескольких белков HCMV (например,g., UL70 и UL105), прогнозируемые на основе последовательности и функциональной гомологии с их аналогами в HSV (1, 5).

HCMV UL105, как полагают, кодирует вирусную геликазу, потому что этот белок содержит шесть мотивов (от I до VI), типичных для суперсемейства 1 класса белков геликазы, которые являются высококонсервативными не только среди всех секвенированных изолятов HCMV, но и среди 32 гомологов геликазы хозяина ( 7). Хеликаза HCMV и ее герпесвирусные гомологи образуют плотный комплекс геликаза-примаза, который состоит из UL105, UL70 и UL102 в HCMV (7-10).Считается, что геликаза UL105 отслеживает отстающую цепь и раскручивает ДНК перед репликационной вилкой, в то время как примаза, кодируемая UL70, синтезирует короткие праймеры РНК для одноцепочечной ДНК, которую ДНК-полимераза удлиняет посредством полимеризации дезоксинуклеозидтрифосфата (1, 5). Хотя точная роль каждой субъединицы требует дальнейшего изучения, можно ожидать, по аналогии с наблюдениями на других герпесвирусах (например, HSV-1), что собранный субкомплекс, содержащий субъединицы UL105 и UL70, сохраняет ферментативную активность, в то время как субъединица UL102 модулирует эти виды деятельности (8, 11–13).

Поскольку репликация геномной ДНК герпесвирусов происходит в ядрах, все белки репликации HCMV, такие как UL105, необходимо импортировать в ядра (14). Были проведены исследования для идентификации белков человека, которые потенциально взаимодействуют с белками HCMV и модулируют их транспорт к ядрам (1). Например, было обнаружено, что многие белки HCMV, в том числе коровые белки репликации ДНК UL44, UL54 и UL57, которые обладают сигнальными последовательностями ядерной локализации (NLS), взаимодействуют с клеточным импортином человека для облегчения их импорта в ядро ​​через комплекс ядерных пор. (15–20).Совсем недавно наша лаборатория (21) показала, что UL70 взаимодействует с клеточным Snapin, белком, ассоциированным с клеточными пузырьками, который преимущественно локализован в цитоплазме (22-24). Модуляция экспрессии Snapin влияет на ядерное и цитоплазматическое распределение UL70, а также на уровни геномной репликации ДНК HCMV и продукцию потомства в культивируемых клетках (21). Эти результаты предполагают, что контроль ядерного импорта и доступность белков репликации HCMV может представлять собой ключевой шаг в регулировании репликации вирусной ДНК.Однако не сообщалось, как кодируемая UL105 эссенциальная геликаза импортируется в ядерный компартмент, где происходит репликация вирусной ДНК (25). Столь же неуловимо то, как модулируется сотовое распространение UL105. В настоящее время нет сообщений о взаимодействии UL105 с какими-либо белками человека.

В этом исследовании мы провели двухгибридный дрожжевой скрининг для выявления белков человека, которые потенциально взаимодействуют с UL105. Наши результаты являются первым прямым доказательством того, что UL105 взаимодействует со Snapin в домене, отличном от домена, связанного с UL70.Кроме того, наши результаты предполагают, что, изменяя клеточную локализацию UL105, Snapin может играть роль в модулировании синтеза вирусной ДНК и литической продуктивной инфекции и может представлять собой возможное средство регулирования персистирующей вирусной инфекции во время патогенеза HCMV.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антитела, вирусы и клетки. Клетки астроцитомы человека U373MG и глиобластомы U251 были получены от Sigma, Inc. (Сент-Луис, Миссури) и Американской коллекции типовых культур (ATCC; Manassas, VA), соответственно.Фибробласты крайней плоти человека (HFF) и клетки U251, HeLa, U373MG и 293T поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (26, 27) и HCMV (штаммы Towne и Towne BAC ). был размножен в этих клетках, как описано ранее (28). Антитела против человеческого актина и Snapin были приобретены у Sigma, Inc. (Сент-Луис, Миссури) и Santa Cruz Biotech, Inc. (Санта-Крус, Калифорния), соответственно. Моноклональные антитела, которые реагируют с белками HCMV UL44, IE1 и gH, были описаны ранее (29, 30).

Для экспрессии антигенов для генерации моноклональных антител против UL70 и против UL105, последовательности, кодирующие UL70 и UL105, клонировали в вектор экспрессии pET-28a (+) (Novagen, Madison, WI). His-меченный UL105 экспрессировали в штамме Escherichia coli BL21 (DE3), очищали гель-электрофорезом и затем использовали для иммунизации мышей BALB / c. Клетки селезенки выделяли от иммунизированных мышей и сливали с клетками миеломы. Положительные слитые клетки отбирали с использованием культуральной среды гипоксантин-аминоптерин-тимидин и иммуноферментного скрининга.Полученные моноклональные антитела собирали из супернатантов культуральной среды положительных культур гибридомных клеток и хранили при -20 ° C. Далее мы охарактеризовали реактивность антител с помощью вестерн-блоттинга, коиммунопреципитации (co-IP) и непрямых иммунофлуоресцентных анализов.

Для создания клеточных линий U251-S, U251-SΔh2, U251-SΔh3 и U251-C использовали ДНК конструкций pCMV-Snapin / UL105, pCMV-SΔh2, pCMV-SΔh3 и пустой вектор [pCDNA3.1 ( +)] соответственно котрансфицировали в клетки U251 с ДНК вектора LXSN (26, 29).Через 48-72 ч после заражения в культуральную среду добавляли неомицин до конечной концентрации 600 мкг / мл. Затем клетки отбирали в присутствии неомицина в течение 2 недель и клонировали устойчивые к неомицину клетки (31, 32). Уровни Snapin и его мутантов в индивидуальных клонах клеток определяли Вестерн-анализом.

Конструкция плазмиды. Конструкции плазмиды, полученные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Конструкция pUL105 была получена из ДНК Towne BAC (28), а конструкция pCMV-XLS-Snapin, содержащая кодирующую последовательность Snapin, была получена из ДНК. приобретено у Origene, Inc.(Роквилл, Мэриленд). Конструкция pGBKT7-UL105, которую использовали для двугибридного скрининга дрожжей, была создана путем клонирования последовательности, кодирующей UL105 HCMV, в pGBKT7, расщепленную NdeI / BamHI (Clontech, Mountain View, CA). Конструкция pCMV-Myc-UL105, которую использовали для экспрессии в клетках человека, была создана путем клонирования последовательности, кодирующей UL105, в расщепленную SalI / KpnI pCMV-Myc (Clontech).

Таблица 1

Плазмидные конструкции, использованные в исследовании

Для создания конструкций pGADT7-Snapin / UL105 и pRK11-FLAG-Snapin, используемых для экспрессии в штамме Saccharomyces cerevisiae Ah209 и в клетках человека, кодирующая последовательность Snapin была амплифицирована с помощью ПЦР с использованием праймеры SNAPIN-F (5′-ATGGATCCTAATGGCGGGGGCTGGTT-3 ′) и SNAPIN-R (5′-ATACTCGAGAATTCTTATTTGCCTGGGGAGCCA-3 ′), а затем вставлены в расщепленные BamHI / XhoI pGADI / FLAGI / расщепленные с помощью EcoR11 pGADT7 и BamR11 соответственно.Конструкции, содержащие последовательности, кодирующие различные мутанты с делецией Snapin, были созданы с помощью ПЦР с использованием pGBKT7-Snapin в качестве матрицы с последующей вставкой амплифицированных продуктов ПЦР в pGBKT7, расщепленный NdeI / BamHI, для двухгибридного анализа дрожжей и расщепленный SalI / KpnI pCMV-Myc и pCDNA3.1 (+) для экспрессии в клетках человека. Полученные конструкции подтверждали профилем рестрикционного переваривания и секвенированием. Конструкция, содержащая последовательность UL83 HCMV, была создана в соответствии с процедурами, описанными ранее (27).

Двухгибридный анализ дрожжей. Мы получили библиотеку кДНК головного мозга плода человека и соответствующие двухгибридные реагенты для скрининга дрожжей (например, штамм Saccharomyces cerevisiae Ah209 и контрольный вектор pGADT7) от Clontech (Mountain View, CA). Мы трансформировали дрожжевой штамм, содержащий pGBKT7-UL105, библиотекой, отобрали положительные клоны на синтетической среде исключения (SD), не содержащей четырех питательных веществ, триптофана, лейцина, аденина и гистидина (SD-минус Trp / Leu / Ade / His; четырехкратное выпадение [ QDO]) и протестировали положительные клоны на активность β-галактозидазы с помощью анализа с фильтром подъема колоний в соответствии с процедурами, рекомендованными производителем, как описано ранее (27).Затем мы экстрагировали конструкции ДНК, содержащие последовательность, кодирующую партнеров по взаимодействию UL105 (обозначенную pACT2-кДНК) из положительных колоний, и последовательности гена человека в конструкциях pACT2-кДНК из этих положительных колоний определяли с помощью праймера для секвенирования 5 ′ -AATACCACTACAATGGAT-3 ′ (27).

Коиммунопреципитация и вестерн-блот-анализ. Мы котрансфицировали клетки плазмидной ДНК с помощью реагента Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Через 48 часов после трансфекции мы собрали клеточные лизаты и провели эксперименты по коиммунопреципитации, используя наборы FLAG tag IP / co-IP для млекопитающих и c-Myc tag IP / co-IP, следуя протоколу производителя (Pierce, Rockford, IL) (27) .В экспериментах по вестерн-анализу денатурированные полипептиды из клеточных лизатов или со-IP разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и переносили электрически на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны блокировали в 5% сухом молоке в фосфатно-солевом буфере (PBS) плюс 0,2% Tween 20, окрашивали различными антителами и реагировали в иммуноферментном анализе с разведенными лошадьми антимышиными IgG антителами 1: 2000, конъюгированными с пероксидаза хрена (Vector Laboratories, Burlingame, CA).Затем мембраны окрашивали хемилюминесцентным субстратом с помощью наборов реагентов для обнаружения вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (GE Healthcare) и количественно определяли либо денситометрией пленок, подвергшихся воздействию образцов, либо с помощью фосфорного сканера STORM840 или станции документирования гелей (Bio-Rad , Hercules, CA) (26, 29). Мы проводили опыты в двух экземплярах и повторяли их трижды. Количественное определение проводили в линейном диапазоне обнаружения белка.

Трансфекция миРНК в клетки.Клетки ( n = 1 × 10 5 ) высевали в 12-луночные планшеты и трансфицировали химически синтетической анти-Snapin h3-малой интерферирующей РНК (миРНК) и контрольными молекулами C-миРНК. Молекулы h3-миРНК представляли собой пул из трех миРНК (h3-1, h3-2 и h3-3), нацеленных на различные области мРНК Snapin, кодирующие домен h3. Олигонуклеотиды были разработаны и химически синтезированы Ribobio Co. Ltd. (Гуанчжоу, Китай) и Santa Cruz Biotech, Inc. (Санта-Крус, Калифорния). В каждой лунке 3 мкл липофектамина (Invitrogen) и 3 мкл 20 мМ миРНК разводили в 12 мкл Opti-MEM и 50 мкл Opti-MEM (Invitrogen) соответственно.Затем мы объединили оба раствора при комнатной температуре через 5 мин. Через 20 мин мы добавляли 400 мкл предварительно нагретого Opti-MEM к каждой реакционной смеси для трансфекции, которую затем добавляли к клеткам. Через 10 часов после трансфекции мы удалили среду, содержащую миРНК, промыли клетки и затем инкубировали клетки с полной DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Трансфекцию повторяли один раз, и через 48 часов после второго раунда трансфекции клетки либо инфицировали, либо готовили для анализа с помощью иммуноблоттинга.

Вирусная инфекция и анализы экспрессии и роста вирусных генов. Клетки ( n = 1 × 10 6 ) были либо ложно инфицированы, либо инфицированы HCMV с множественностью инфекции (MOI) от 0,5 до 5 после экспериментальных процедур. описано ранее (26, 29). Для анализа экспрессии вирусных генов мы выделили образцы белка из инфицированных клеток через 12-72 часа после заражения, и образцы белка были проанализированы с помощью экспериментов вестерн-блоттинга, как описано ранее (29, 30).Для анализа роста вируса мы инфицировали клетки ( n = 1 × 10 5 ) HCMV с MOI 1. Мы собрали клетки и среду через 5 дней после инфицирования и приготовили исходные вирусные растворы, добавив равный объем 10%. (об. / об.) обезжиренное молоко с последующей обработкой ультразвуком. Мы определили титры исходных вирусов, инфицировав 1 × 10 5 фибробластов крайней плоти человека и подсчитав количество бляшек через 10–14 дней после инфицирования. Полученные значения были средними из трех экспериментов.

Анализ уровня внутриклеточной вирусной ДНК. Мы провели количественный ПЦР в реальном времени (кПЦР) анализ вирусной ДНК, как описано ранее (33). Вкратце, мы выделили образцы ДНК из ложно инфицированных или инфицированных HCMV клеток с использованием набора тканей DNeasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Уровни внутриклеточной вирусной ДНК количественно определяли с помощью праймеров P53 (5′-GTCAGCGTTCGTGTTTCCCA-3 ‘) и P33 (5′-GGGACACAACACCGTAAAGC-3′) и зонда для амплификации последовательности UL83 HCMV. Зонд TaqMan (5’-FAM-CCCGCAACCCGCAACCCTTCATG-TAMRA-3 ‘, где FAM представляет собой 6-карбоксифлуоресцеин, а TAMRA представляет собой 6-карбокситетраметилродамин) был приобретен у Applied Biosystems Inc.(Фостер-Сити, Калифорния) и был помечен на 5′-конце FAM и на 3’-конце флуоресцентным гасителем TAMRA. Мы нормализовали количество вирусных геномов к количеству клеточных копий β-актина с помощью ранее описанного набора праймеров и зонда (33). Неизвестные значения образца определяли на основе стандартной кривой известных чисел копий UL83 (Towne BAC ) и β-актина (pβ-актин). Мы провели ПЦР-амплификацию в 50-мкл реакционной смеси (которая содержала 21 мкл экстракта ДНК, 25 мкл 2-кратной мастер-смеси TaqMan Universal PCR [Applied Biosystems Inc.], 1 мкл каждого праймера при 10 мкМ, 2 мкл флуорогенного зонда при 5 мкМ) с использованием устройства ABI 7500 (Applied Biosystems Inc., Фостер-Сити, Калифорния) или системы обнаружения ПЦР в реальном времени iCycler (Bio- Рад, Геркулес, Калифорния). Условия термоциклирования были следующими: 50 ° C в течение 2 минут, 95 ° C в течение 15 минут и 45 циклов при 95 ° C в течение 30 с и 60 ° C в течение 1 минуты. Результаты ПЦР были получены в трех независимых экспериментах.

Приготовление ядерных и цитоплазматических экстрактов. Мы ресуспендировали клетки в буфере А (10 мМ HEPES [pH 7.4], 10 мМ KCl, 1 мМ дитиотреитол, 0,6% NP-40) при 4 ° C в течение 10 мин. После центрифугирования при 1000 × g в течение 5 минут супернатант собирали в виде цитоплазматической фракции, а ядерную фракцию получали путем ресуспендирования оставшегося осадка в буфере B (20 мМ HEPES [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол. ). Мы окрашивали ядерные и цитоплазматические экстракты на наличие UL70, UL105, актина и гистона h2 с помощью иммуноблоттинга.

Иммунофлуоресцентный микроскопический анализ.Клетки (выращенные на покровных стеклах) котрансфицировали ДНК различных конструкций и через 48 часов после трансфекции либо ложно инфицировали, либо инфицировали HCMV при MOI от 1 до 5 (34). В разные моменты времени после инфицирования клетки фиксировали 4% формальдегидом, блокировали 0,1% бычьим сывороточным альбумином и 0,1% азидом натрия в PBS и окрашивали первичными антителами с последующей инкубацией со вторичными антителами Alexa Fluor 555 против IgG мыши или Alexa. Fluor 488 против кроличьих IgG (Invitrogen).DAPI (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол) использовали для окрашивания ядер (Invitrogen). Мы собрали конфокальные изображения с помощью конфокального микроскопа Olympus FV1000 по отдельным каналам и проанализировали изображения с помощью программного обеспечения Olympus Fluoview. Мы определили процент цитоплазматического и ядерного UL105 по крайней мере в трех независимых экспериментах. В некоторых экспериментах мы также получали изображения с помощью микроскопа Nikon Eclipse TE300 с использованием камеры SPOT RT Slider и программного обеспечения для обработки изображений (Diagnostic Instruments, Inc., Стерлинг-Хайтс, Мичиган) (34). Впоследствии цифровые изображения были объединены с использованием программного обеспечения SimplePCI (Compix Inc., Sewickley, PA). Для некоторых экспериментов мы также вручную подсчитали клетки, демонстрирующие различные паттерны локализации UL105, и определили процентное соотношение количества клеток по крайней мере в трех независимых экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Взаимодействие Snapin с UL105, выявленное с помощью двугибридного анализа дрожжей. Чтобы идентифицировать клеточные факторы, которые потенциально взаимодействуют с UL105, мы провели двухгибридный скрининг дрожжей путем трансформации S.cerevisiae Ah209, содержащий pGBKT7-UL105, который содержит полноразмерную кодирующую последовательность UL105, с библиотекой кДНК, полученной из мозга плода человека. Те дрожжевые клетки, которые росли на синтетической среде отсева (SD), лишенной четырех питательных веществ, триптофана, лейцина, аденина и гистидина (SD-минус Trp / Leu / Ade / His), и давали синие сигналы в тесте с фильтром подъема колоний для β -галактозидазной активности (27). Одна из идентифицированных конструкций, pACT2-SNAPIN / UL105, которая содержала полноразмерную кодирующую последовательность Snapin, постоянно взаимодействовала с UL105 в наших дрожжевых двухгибридных скринингах (данные не показаны).Из почти 1,5 × 10 7 протестированных независимых кДНК клонов 27 дрожжевых колоний дали положительные результаты, и 13 из них содержали плазмидные конструкции с полноразмерной кодирующей последовательностью Snapin.

Взаимодействие Snapin с UL105 в клетках человека, выявленное с помощью co-IP. В наших анализах co-IP мы сначала клонировали последовательности, кодирующие Snapin и UL105, в векторы экспрессии млекопитающих pRK11-FLAG и pCMV-Myc для создания конструкций pRK11-FLAG -Snapin и pCMV-Myc-UL105, соответственно, в которых каждая открытая рамка считывания (ORF) экспрессировалась как гибридный белок с аминоконцевой меткой FLAG и меткой эпитопа Myc, соответственно (22-24, 28).Лизаты белков из клеток глиобластомы U251 человека, трансфицированные этими конструкциями, сначала иммунопреципитировали либо анти-FLAG, либо анти-Myc, а затем иммуноблотировали с антителами против меток эпитопа FLAG и Myc. Мы наблюдали соосаждение помеченного Myc UL105 с помеченным FLAG Snapin (рис. 1, дорожки 4 и 11). Напротив, в контрольных экспериментах мы не обнаружили значительного связывания или соосаждения между UL105, меченным Myc, и UL83, меченным FLAG, HCMV, который, как известно, не взаимодействует с UL105 и служит отрицательным контролем (дорожки 1-3 и 7 для 9) (27).Мы также наблюдали аналогичные результаты в клетках HeLa, клетках 293T, клетках астроцитомы U373MG и инфицированных HCMV клетках U251, трансфицированных конструкциями, экспрессирующими меченый FLAG Snapin и меченный Myc белки UL105 (данные не показаны). Эти наблюдения подтвердили специфичность анализа co-IP и предположили, что взаимодействие UL105-Snapin может происходить в клетках человека.

Рис. 1

Идентификация взаимодействия между UL105 с тегами Myc и Snapin с тегами FLAG по совместному IP. Клетки U251 человека котрансфицировали комбинацией двух плазмид, экспрессирующих белки, меченные FLAG и Myc.Клеточные лизаты получали через 48 часов после трансфекции. Образцы входящего белка (70 мкг; вход, дорожки 3, 6, 9 и 12) и образцы (10 мкг), которые были иммунопреципитированы либо анти-Myc [IP (анти-Myc), дорожки 2, 5, 8 и 11] или антитела против FLAG [IP (анти-FLAG), дорожки 1, 4, 7 и 10] разделяли на SDS-содержащих полиакриламидных гелях и анализировали с помощью анти-Myc (анти-Myc) и анти-FLAG (анти- -FLAG) антитела соответственно.

Чтобы определить, взаимодействует ли нативный (немаркированный) UL105 специфически с эндогенным Snapin в клетках человека и при наличии инфекции HCMV, мы экспрессировали UL105 в E.coli и использовали экспрессированный белок в качестве антигена для получения моноклонального антитела против UL105. Чтобы определить, может ли Snapin неспецифически взаимодействовать с другими вирусными белками в дополнение к UL105, мы также исследовали, связан ли Snapin с UL44, который кодирует фактор процессивности полимеразы HCMV, необходимый для репликации вирусной ДНК (1). Белковые лизаты из инфицированных HCMV клеток U251 сначала иммунопреципитировали либо анти-UL105, либо анти-UL44, либо анти-Snapin, а затем иммуноблотировали с помощью антител против UL105, UL44 и Snapin.UL105 соосаждался с эндогенным Snapin (фиг. 2, дорожки 7 и 11), в то время как мы не наблюдали значительного связывания или соосаждения между UL44 и Snapin (фиг. 2, дорожки с 1 по 6). Аналогичные результаты наблюдались также для HFF, инфицированных HCMV, и неинфицированных клеток HeLa, 293T и U251, трансфицированных pCMV-UL105 и pCMV-UL44 (данные не показаны). Эти результаты предполагают, что Snapin может специфически взаимодействовать с UL105, но не с UL44 во время инфекции HCMV.

Рис. 2

Co-IP вирусных белков и клеточного Snapin в инфицированных HCMV клетках.Клетки U251 человека инфицировали HCMV (MOI = 1), и клеточные лизаты получали через 72 часа после инфицирования. Образцы входящего белка (60 мкг; входные, дорожки 3, 6, 9 и 12) и образцы (15 мкг), которые были иммунопреципитированы анти-UL44 [IP (анти-UL44), дорожки 2 и 5], анти-UL105 Антитела [IP (анти-UL105), дорожки 8 и 11] или анти-Snapin [IP (анти-Snapin), дорожки 1, 4, 7 и 10] разделяли на SDS-полиакриламидных гелях и анализировали с помощью анти-UL44. (анти-UL44), анти-UL105 (анти-UL105) и анти-Snapin (анти-Snapin) антитела соответственно.

Критические роли консервативного домена h3 спиральной спирали Snapin во взаимодействии с UL105.Snapin содержит N-концевой гидрофобный домен (аминокислоты [aa] от 1 до 20) и два консервативных домена спиральной спирали, h2 (амино кислоты 37-65) и h3 (аминокислоты 81-126) (22, 23). Было показано, что домен h3 является основным сайтом связывания для SNAP23, в то время как белки не взаимодействуют с доменом h2 (22, 23). Чтобы картировать домены Snapin, необходимые для взаимодействия с UL105, мы сконструировали серию усеченных мутантов Snapin для двухгибридных анализов дрожжей (рис.3). Кроме того, мы сгенерировали серию экспрессионных конструкций млекопитающих (таблица 1), которые кодировали мутанты усечения Snapin с тегами FLAG (рис. 3). Эти конструкции затем котрансфицировали с pCMV-UL105 в клетки U251, и взаимодействия между UL105 и различными мутантами Snapin, меченными FLAG, исследовали в экспериментах по коиммунопреципитации (фиг. 4). Результаты, обобщенные на фиг.3, показывают, что делеция домена h3 [например, в мутанте SΔh3 (81-126aa)] устраняет способность Snapin взаимодействовать с UL105, в то время как делеция каждой из оставшихся областей (например,g., аминоконцевой гидрофобный участок и домен h2) не влияли на связывание Snapin с UL105 (фиг. 4). Таким образом, консервативная последовательность h3 Snapin важна для его взаимодействия с UL105.

Рис. 3

Схематическая диаграмма Snapin и его делеционных мутантов, которые взаимодействуют с UL105 и UL70, как было идентифицировано дрожжевым двугибридным (YTH) скринингом и ко-IP в клетках U251. + и -, положительные и отрицательные взаимодействия, соответственно, в двугибридном экране или со-IP.

Рис. 4

Идентификация взаимодействия между UL105 и различными мутантами Snapin, помеченными FLAG, по ко-IP.Клетки U251 человека котрансфицировали pCMV-UL105 и плазмидой, экспрессирующей FLAG-меченый белок Snapin с различными мутациями. Клеточные лизаты получали через 48 часов после трансфекции. Образцы входящего белка (50 мкг) (входные, дорожки с 1 по 8) и образцы (10 мкг), которые были иммунопреципитированы анти-UL105 [IP (анти-UL105), дорожки 9–16), разделяли на SDS-содержащих полиакриламидных гелях. и анализировали с помощью антител против FLAG (anti-FLAG).

Клеточная локализация UL105 и Snapin в клетках человека.Если UL105 связан (или связывается с) Snapin в клетках, ожидается, что эти белки будут локализоваться в одних и тех же клеточных компартментах. Микроскопический анализ показал, что как Myc-tagged UL105, так и FLAG-tagged Snapin были преимущественно локализованы в цитоплазме в клетках U251, трансфицированных конструкциями (фиг. 5a-d). Для дальнейшего подтверждения этих результатов и исследования клеточной локализации немеченых белков UL105 и эндогенных белков Snapin клетки трансфецировали pCMV-UL105, который содержал последовательность, кодирующую немаркированный UL105, а затем окрашивали антителами против UL105 и против Snapin.Подобно результатам, полученным с мечеными белками (фиг. 5a-d), было обнаружено, что как UL105, так и Snapin преимущественно локализованы в цитоплазме (фиг. 5e-h). Мы также наблюдали цитоплазматическую локализацию этих двух белков в клетках HeLa и HFF (данные не показаны). Анти-UL105 оказался специфичным, поскольку окрашивание этим антителом наблюдалось только в клетках, трансфицированных pCMV-UL105, а не в пустом векторе pCDNA3.1 (+) (фиг. 5i-l). Локализация UL105 может не полностью перекрывать локализацию Snapin, возможно, потому, что оба белка динамически экспрессируются в клетках, а избыточная экспрессия UL105 может приводить к неправильному распределению небольшого количества UL105 в этих клетках.В соответствии с нашими результатами двухгибридных скринингов и экспериментов по совместному IP, эти результаты предполагают, что последовательности тегов в Myc-UL105 и FLAG-Snapin не влияют на взаимодействие и совместную локализацию UL105 со Snapin и что Snapin может специфически взаимодействовать с UL105. . Кроме того, эти результаты предоставляют прямые доказательства того, что UL105 преимущественно локализуется в цитоплазматическом компартменте неинфицированных клеток.

Рис. 5

Совместная локализация UL105 и Snapin, экспрессированных в клетках человека.Клетки котрансфицировали конструкциями pCMV-Myc-UL105 и pRK11-FLAG-Snapin (от a до d), отдельно от pCMV-UL105 (от e до h) или только pCDNA3.1 (+) (от i до l), фиксированных через 48 часов. посттрансфекция, окрашивание антителами DAPI (a, e и i), anti-FLAG (b), anti-Myc (c), anti-Snapin (f и j) и анти-UL105 (g и k) и визуализация с помощью конфокального микроскопа (Olympus FV1000). Изображения Snapin (b, f и j), UL105 (c, g и k) и ядер, окрашенных DAPI (a, e и i), были использованы для создания составных изображений (d, h и l). .На изображениях показаны разные уровни увеличения.

Модуляция клеточной локализации UL105 за счет повышения и подавления экспрессии Snapin. Поскольку синтез вирусной ДНК происходит в ядрах во время инфекции HCMV, UL105, основная геликаза, должна быть локализована в ядерном компартменте. Наши результаты о том, что UL105 взаимодействует с цитоплазматическим белком Snapin и преимущественно локализуется в цитоплазме неинфицированных клеток, повышают вероятность того, что Snapin может изолировать UL105 и влиять на его клеточную локализацию посредством связывания.Если это так, ожидается, что UL105 будет накапливаться в клетках, которые сверхэкспрессируют Snapin или мутант Snapin с активностью связывания UL105, но не мутант, не проявляющий связывания с UL105. Чтобы изучить влияние сверхэкспрессии Snapin на клеточную локализацию UL105, мы сконструировали клеточную линию U251, U251-S, которая конститутивно экспрессировала полноразмерный белок Snapin, и контрольную клеточную линию, U251-C, которая содержала пустую экспрессию вектор. Кроме того, мы создали две дополнительные клеточные линии, U251-SΔh2 и U251-SΔh3, которые экспрессировали мутанты Snapin SΔh2 (37-65aa) и SΔh3 (81-126aa) соответственно.SΔh2 (37-65aa) содержал делецию консервативного спирального домена h2 (аминокислоты от 37 до 65) и был способен связываться с UL105 в дрожжевых двухгибридных анализах и экспериментах по коиммунопреципитации в клетках U251, в то время как SΔh3 (81-126aa) содержал делеция консервативного спирального домена h3 (аминокислоты с 81 по 126) и отсутствие связывания с UL105 (фиг. 3). Вестерн-блоттинг лизатов инфицированных HCMV клеток показал ~ 5-кратное повышение уровня белка Snapin в клетках, экспрессирующих Snapin и его мутанты, по сравнению с уровнями в родительских клетках U251 и контрольных клетках U251-C (рис.6). Сконструированные клеточные линии и родительские клетки U251 были неотличимы с точки зрения их роста и жизнеспособности в течение 3 месяцев (данные не показаны), что позволяет предположить, что сверхэкспрессия Snapin не приводила к значительной цитотоксичности.

Рис. 6

Экспрессия Snapin и его мутантов в клетках. Вестерн-блоттинг был использован для определения уровней Snapin, UL70 и UL105 в родительских клетках U251 (U251) (дорожки 1 и 5), клетках, которые экспрессировали полноразмерный Snapin (U251-S; дорожки 2 и 6), и Мутанты Snapin SΔh2 (37-65aa) (U251-SΔh2; дорожки 3 и 7) и SΔh3 (81-126aa) (U251-SΔh3; дорожки 4 и 8).Клетки либо трансфицировали молекулами h3-siRNA против Snapin (дорожки 2–4), либо не трансфицировали никакими siRNA (дорожки 1 и 5–8) и либо ложно инфицировали (дорожка 1), либо инфицировали HCMV при MOI 1 через 48 ч инкубации миРНК (дорожки 2-8). Экспрессию клеточного актина использовали в качестве контроля внутренней нагрузки.

Чтобы изучить локализацию UL105 в инфицированных HCMV клетках, мы трансфицировали сконструированные клеточные линии pCMV-Myc-UL105, а затем инфицировали эти клетки HCMV.Мы использовали MOI от 1 до 5, чтобы гарантировать, что большинство клеток было инфицировано. Действительно, экспрессия IE1 была обнаружена в большинстве клеток, когда клетки были окрашены антителом против IE1 (данные не показаны). Инфекция HCMV, по-видимому, способствует ядерному импорту UL105 в клетки U251, поскольку мы обнаружили значительное количество сигнала UL105 в ядрах через 48-72 часа после инфицирования по сравнению с таковым в неинфицированных клетках (сравните рис. 7a-c с рис. 5). ). В присутствии инфекции HCMV локализация UL105 в клетках U251-S значительно отличалась от таковой в родительских клетках U251 и контрольных клетках U251-C.Через 48 часов после инфицирования UL105 локализовался исключительно в цитоплазме клеток U251-S (96% цитоплазматических против 4% ядерных) (фиг. 7d-f; таблица 2). Напротив, UL105 был распределен как в цитоплазме, так и в ядрах клеток U251 и U251-C (60% ядер против 40% цитоплазматических) (рис. 7a-c; таблица 2). Аналогичные результаты также наблюдались, когда клетки трансфицировали pCMV-UL105 вместо pCMV-Myc-UL105 и окрашивали антителом против UL105 (таблица 2), что согласуется с нашими наблюдениями, что последовательность метки не влияет на взаимодействие и совместную локализацию UL105. со Snapin (рис.1, 2 и 5).

Рис. 7

Влияние измененной экспрессии Snapin и его мутантов на клеточное распределение UL105. Клеточная локализация UL105 в родительских клетках U251 (U251; от a до c), клетках, сверхэкспрессирующих полноразмерный белок Snapin (U251-S; от d до f), мутантах SΔh2 (37-65aa) (U251-SΔh2; от g до i) и SΔh3 (81-126aa) (U251-SΔh3; j к l) или обработанные анти-Snapin h3-siRNA клетки U251-S (h3-siRNA U251-S; m к o). Клетки трансфицировали pCMV-Myc-UL105 в отсутствие и в присутствии миРНК, инфицировали HCMV (MOI = 5) через 48 часов после трансфекции, фиксировали через 48 часов после заражения, окрашивали антителами и визуализировали с помощью конфокального микроскопа (Olympus FV1000). .Изображения ядер, окрашенных DAPI (синий) (a, d, g, j, m) и Myc-tagged UL105 (зеленый) (b, e, h, k, n), были использованы для создания составных изображений (c , f, i, l, o). На изображениях показаны разные уровни увеличения.

Таблица 2

Процентное содержание UL105, локализованного в ядрах или цитоплазме a

Локализация UL105 в клетках U251-SΔh2, которые экспрессировали мутантный SΔh2 (37-65aa), проявляющий активность связывания UL105, была исключительно в цитоплазме и был подобен таковому в клетках U251-S (рис.От 7g до i; Таблица 2). Напротив, локализация UL105 в клетках U251-SΔh3, которые экспрессировали мутантный SΔh3 (81-126aa), не проявляющий активности связывания UL105, была как цитоплазматической, так и ядерной и была аналогична таковой в клетках U251 и U251-C (рис. 7j). к l; таблица 2). Эти результаты предполагают, что сверхэкспрессия Snapin приводит к снижению ядерного импорта UL105 и накоплению UL105 в цитоплазме и что связывание Snapin необходимо для наблюдаемого изменения клеточного распределения UL105.

Ожидается, что подавление экспрессии Snapin может способствовать ядерному импорту UL105, на основании наших наблюдений, что избыточная экспрессия Snapin ведет к цитоплазматическому накоплению UL105.